jueves, 2 de abril de 2015

Liofilización de sangre humana y manzana, y posterior rehidratación - morfología

Introducción

La liofilización es un proceso que busca conservar la estructura y viabilidad celular por medio de la deshidratación de un producto termo lábil bajando la temperatura e incrementando la presión. Existen investigaciones que aseguran que los eritrocitos son células que pueden ser sometidas a este proceso, conservando sus propiedades y la función de la hemoglobina que s la proteína más importante en este tipo de estructura  celular (Chicaiza, 2013).

La determinación de las propiedades morfológicas, fisiológicas y bioquímicas de la sangre periférica y los órganos productores de sangre (sistema hematopoyético) es una función del laboratorio hematológico.

La sangre periférica es un sistema liquido bifásico de características tisulares compuesto por elementos celulares suspendidos en una fase liquida de plasma. La fase celular abarca aproximadamente un 45% del volumen sanguíneo y contiene eritrocitos (glóbulos rojos), leucocitos (glóbulos blancos) y trombocitos (plaquetas).

El eritrocito normal (normocito) es una estructura flexible, elástica, bicóncava y deprovista de núcleo, con un diámetro medio de 7.3 µm y un espesor aproximado de 2.2 µm. Los constituyentes químicos de los eritrocitos son agua (63%), lípidos (0.5%), glucosa (0.8%), proteína no hemoglobina (0.9%), metahemoglobulina (0.5%) y hemoglobina (33.6%). Su función principal es el transporte de oxígeno y dióxido de carbono.

Su membrana, un componente dinámico y semipermeable de la célula, se asocia con el metabolismo energético en el mantenimiento de las características de permeabilidad de la célula a diversos cationes (Na+, K+) y aniones (Cl -, HCO3) (Remington, 2003).



En la industria alimentaria, es muy usado el método de liofilización, una vez liofilizados los alimentos, el tiempo de conservación sin refrigeración aumenta por que la reducción de contenido de agua inhibe la acción de los microorganimos patógenos que podrían deteriorar el alimento. Se liofilizan ciertas frutas para cerales, que mantienen el 98% de las propiedades naturales, sopas instantáneas, hierbas y especias (Chavarrias, 2010).


Coloracion de Wright
El típico color de los nucleos celulares, mayoritariamente rojo purpura, se basa en la interaccion molecualr entre eosina y un complejo azul B-ADN. Ambos colorantes forman el complejo. La intensidad de la coloración depende del contenido de azul B y de la relación entre azul B y eosina amarilla. El resultado de tinción y de la solución tampón, las sustancias tampón (amortiguadores), el tiempo de tinción y la fijación (IHR Ltda, 2007).


MATERIALES Y MÉTODOS

<<<<< SANGRE HUMANA >>>>>
Extracción de sangre
Se extrajeron XXXX mL de sangre de un voluntario, utilizando una jeringa estéril.
Preparación de las soluciones
Se realizaron 10 soluciones de sacarosa de distintas concentraciones, desde 1/256 M hasta 2 M. De cada una de estas, se tomaron 400 µL y se mezclaron con 100 µL de sangre y 50 µL de DMSO, obteniendo 10 soluciones de sangre con distinta concentración de glucosa.
Tratamiento de las soluciones.
24 horas después de hacer las soluciones, se congelan a -20°C por una semana. Después, se liofilizan todas las muestras en el ciclo normal del equipo del laboratorio.
Reconstitución y observación de las células liofilizadas
Una vez liofilizadas las muestras, se dejan a temperatura ambiente por una hora y se reconstituyen con solución fisiológica. Se utilizó la tinción de Wright para que sean distinguibles las células. Después de que se enjuagó el colorante, se secó y colocó el cubreobjetos para observar en el microscopio.

<<<<< MANZANA YA LIOFILIZADA >>>>>
-Se pesó la cantidad de manzana liofilizada a rehidratar.
-Se metió en un vidrio de reloj que contenía agua purificada.
-Se sacó cada 30 segundos hasta los 5 minutos, y después cada 2 minutos hasta que el peso fuera constante.
-Se pesaba en cada intervalo de tiempo procurando eliminar el agua circundante de la manzana con un papel absorbente, pero sin presionar demasiado para evitar la salida del agua que había absorbido la manzana o dañar su estructura.
-Se registraron los datos y graficaron con respecto al tiempo.

RESULTADOS

Rehidratación de manzana liofilizada

Figura 1. Apariencia física de los pedazos de manzana liofilizada, proporcionada por el profesor, a los distintos tiempos de rehidratación en agua. Se observa cómo la muestra inicial aparece mucho más delgada (como el peso de la tabla lo indica) que el resultado final a los 11 minutos de mantener en agua.

Tabla 1. Pesos de los trozos de manzana liofilizada sumergida en agua a los distintos tiempos. A partir de los cinco minutos el peso se mantiene constante. La rehidratación se detuvo a los 11 minutos.
Tiempo (min)
Peso (g)
0
0.0501
0.5
0.0892
1
0.1099
1.5
0.1035
2
0.1198
2.5
0.1187
3
0.1287
3.5
0.1397
4
0.1457
4.5
0.1538
5
0.1724
7
0.1729
9
0.175
11
0.1728

Liofilización y resuspensión de eritrocitos


Figura 2. Muestras de sangre en la solución correspondiente de 400 µL glucosa (0.5 M y 0.25 M para los tubos 3 y 4, respectivamente), con 50 µL de DMSO.


Figura 3. Muestras de sangre liofilizada y resuspendida en solución salina colocadas en portaobjetos de las soluciones 3 y 4. A la derecha se observa la tinción de Wright.


Figura 4. Vista al microscopio (100x, inmersión de aceite) de los eritrocitos liofilizados en solución No. 1 y posteriormente resuspendidos en solución salina y teñidos con tinción de Wright.


Figura 5. Vista al microscopio de los eritrocitos liofilizados (solución No. 3), rehidratados (en solución isotónica) y posterior tinción de Wright (vista 100x, inmersión de aceite).


Figura 6. Vista al microscopio (100x, inmersión de aceite) de los eritrocitos liofilizados en solución No. 4, rehidratados en suspensión salina y teñidos con tinción de Wright.

DISCUSIÓN

Rehidratación de manzana liofilizada

Se observan en la Figura 1 las muestras de manzana liofilizada proporcionadas por el profesor, durante el proceso de rehidratación. La rehidratación se hizo en agua purificada durante 11 minutos, tiempo en el cual ya no hubo variación de peso por hidratación de la muestra por lo que se detuvo la rehidratación. Se observa una diferencia visual notable entre la muestra inicial (tiempo cero) y la final (tiempo 11 minutos), siendo la primera de una consistencia seca color verdoso y la segunda una consistencia jugosa con un color amarillento debido a la oxidación de la manzana durante el tiempo de realización del experimento, cosa que no sucedía mientras la manzana estuviera liofilizada (es una de las ventajas de la liofilización, que los alimentos tardan más tiempo en oxidarse).

La tabla 1 así como la Figura 7 muestran el aumento lineal inicial  del peso de la manzana en proceso de rehidratación respecto al tiempo. Posteriormente, a los 5 minutos, el aumento de peso lineal se detiene y se estabiliza en alrededor de 0.17 gramos, del que ya no varía hasta los 11 minutos. Esto indica que la manzana liofilizada contenía menos de 3.5 veces la cantidad de agua que debió contener la fruta natural. Esto último es importante porque es otra de las ventajas de la liofilización, que disminuye de forma considerable la actividad de agua, impidiendo con ello el desarrollo de microorganismos y aumentando el tiempo de vida útil del producto.


Figura 7. Gráfica de los pesos de la manzana liofilizada cuando se sumergió en agua para rehidratar y se pesó en la balanza analítica primero cada 30 segundos y luego cada dos minutos. Como se observa, el peso se mantuvo constante a partir de los 5 minutos alrededor de 0.17 gramos. Dado que el peso inicial de la manzana liofilizada era de 0.0501 g, el proceso de rehidratación aumentó el peso de la manzana en un factor de 3.5 veces.

Resuspensión de células de eritrocitos liofilizadas

La Figura 3, derecha, muestra la tinción de Wright, es una modificación de Romanowsky que se utiliza en la tinción diferencial de elementos celulares de la sangre, el núcleo de leucocitos y el citoplasma adoptan la coloración característica azul o rosa. Se realizó la tinción de Wright lográndose observar los eritrocitos mostrados en las Figuras 4-6 usando un microscopio óptico. Las soluciones de glucosa de 2, 0.5 y 0.25 M usadas y mostradas en las Figuras 4, 5 y 6 son todas hipertónicas, por ser de concentración mayor a 145 mM. Una solución hipotónica no sería buena opción cómo se explicará en breve.

La figura 4 en la que se liofilizaron los glóbulos rojos previamente sumergidos en solución de glucosa 2 M por una semana y después se resuspendieron en solución salina de NaCl 0.85% y se tiñeron con Wright, se observa que los eritrocitos están mejor conservados que los mostrados en las figuras 5 y 6, donde las soluciones de glucosa usadas fueron de 0.5 y 0.25 M, respectivamente. El hecho que los eritrocitos de la Figura 4 estén mejor conservados después de resuspenderlos es que la solución de glucosa 2 M actuó como una solución hipertónica que crenó los eritrocitos previo a la liofilización (véase Figura 8), eliminando con ello agua de dentro del eritrocito que de no ser así habría formado cristales grandes que habrían roto la membrana. Además de actuar como solución hipertónica, las altas concentraciones de glucosa inhiben el crecimiento de cristales de hielo y disminuyen el punto de fusión de la solución.

En la figura 5 se observa que solo hay una célula con poco daño en la superficie, las demás no se logran distinguir debido a la adición de DMSO a temperatura ambiente, lo que ocasionó la muerte de las células, se debe adicionar cuando las células ya están congeladas.


Figura 8. Izquierda: Eritrocitos en solución hipotónica de NaCl. Centro: Eritrocitos en solución fisiológica isotónica de NaCl (0.85%) . Derecha: Eritrocitos en solución hipertónica de NaCl.

En la Figura 8 se observan soluciones de diferentes tonicidades de eritrocitos en  NaCl. Éstas fueron realizadas varias sesiones antes de la práctica dentro del mismo laboratorio de Liofilización, por lo que sólo mostramos los resultados. Se observa que en una solución hipotónica las células se han llenado de agua por la presión osmótica del medio sobre la membrana. En éste caso, no sería buena idea liofilizar puesto que debido a la alta concentración de agua dentro de la célula, se formarán cristales que podrían romper la membrana. En la solución isotónica (NaCl 0.85%) los eritrocitos están en equilibrio con el medio y no hay absorción ni liberación neta de agua. Aún aquí, no sería recomendable la liofilización. Finalmente, en la solución hipertónica se observan los eritrocitos crenados. Aquí, sí sería conveniente liofilizar pues debido a que han perdido agua, es menos posible que se formen cristales dentro de la célula que puedan dañar la membrana.


CONCLUSIONES

-          El tiempo requerido para la rehidratación de una muestra de tres trocitos de manzana liofilizada en agua purificada fue de alrededor de 5 minutos, tiempo después del cual ya no mostró aumento del peso por absorción de agua.
-          Las soluciones hipertónicas son mejores para llevar a cabo la congelación previa a la liofilización que las soluciones hipotónicas.
-          El DMSO debió haberse agregado después del congelamiento para evitar la muerte de las células ya que es muy tóxico. Sin embargo, sí se logró liofilizarlas y resuspenderlas aunque ya muertas.
-          Los eritrocitos obtenidos después de la liofilización y resuspensión fueron mejores cuando se dejó la muestra de sangre en solución de glucosa 2 M por una semana que si se dejó en una solución de glucosa 0.5 ó 0.25 M por el mismo período de tiempo.

BIBLIOGRAFÍA

-Day, J.G. y McLellan, M.R. (1995). Methods in Molecular Biology, Vol. 38: Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols (1a ed.). Totowa, NJ: Humana Press, pp. 192-206
-Navas Ramirez y Sebastian Juan. (2006). Liofilizacion de Alimentos. Revista Recitela. Colombia. Pp 2,9,11-12.
-Oetjen, G.W. y Haseley, P. (2004). Freeze-Drying (2ª ed.). Alemania: Wiley-VCH, pp. 108, 367-372. 


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