viernes, 3 de abril de 2015

Establecimiento de un Cultivo de Callos de Explantes de Zanahoria

 OBJETIVOS
Preparar medios de cultivo para el cultivo in vitro de tejidos vegetales
Familiarizarnos con  las técnicas de cultivo de vegetales in vitro y establecer cultivos de callos.


 INTRODUCCIÓN

El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales, un ejemplo de un cultivo in vitro es el establecimiento de callo que es  un tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados, los cuales posteriormente son llevados a una proliferación continua, acelerada y de apariencia desorganizada que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar diferentes tipos morfológicos, los cuales varían según la apariencia externa de la célula.

El callo esta generalmente constituido por una alta proporción de células en las que las vacuolas son predominantes, similares a las células del parénquima. Las respuestas cualitativas y cuantitativas del crecimiento de callo en cultivo involucran un sinergismo estrecho y complejo entre el origen del tejido usado para la primera inducción, la composición del medio, es decir el éxito que se obtenga en un cultivo celular tanto de callos como de otro depende del uso del medio nutritivo adecuado, como también del empleo de tejidos viables, incubación, calidad de reactivos. Los ingredientes del medio de cultivo  se clasifican en sales inorgánicas (mezclas de sales), compuestos orgánicos(esto incluye la fuente de carbono, sustancias hormonales, vitaminas, aminoácidos y amidas), complejos naturales y materiales inertes de soporte.

La inducción de callo a partir de una porción vegetal sucede cuando el inoculo ya estéril se pone en contacto con un medio de cultivo que induzca y mantenga un crecimiento y una división celular continua (Yeoman y Macleod, 1977).esto incluye la concentración de los reguladores hormonales presentes en el medio de cultivo, la característica mas importante  del callo el la totipotencialidad de sus células, ya que, en general, con un manejo adecuado de las condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, tienen la capacidad de desarrollar brotes, raíces, embriones, etc. los cuales pueden llegar a formar plántulas completas y la coloración de de el tejido calloso varia, aun  derivando de la misma especie (se pueden presentar callos que carecen de pigmentación mientras que otros pueden ser de diferentes tonos de verde, amarillo, café o rojo).El tipo y grado de pigmentación esta marcadamente influenciado por factores ambientales y nutricionales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos y antocianinas(que son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las células vegetales y que otorgan el color rojo, púrpura o azul a las hojas, flores y frutos).


DESARROLLO EXPERIMENTAL
RESULTADOS

Equipo
Auxinas
Citocinina
1
2X
1X
2
2X
1X
3
1X
1X
4
1X
1X
5
1X
2X
6
1X
2X
7
0.5X
1X
8
0.5X
1X
9
MS/2
Tabla 1 concentración de los reguladores hormonales utilizados por cada equipo en el medio de cultivo.


Cultivo de callos a 4 semanas de inicial el cultivo.

En esta imagen se observa de forma más clara la formación de callo en el explane de zanahoria después de 4 semanas que es la edad promedio de crecimiento (teóricamente el cultivo de callos se deja en crecimiento para ver resultados de 3 a 4 semanas).


ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS
El cultivo se realizó a partir del cambium de zanahoria
Las células del cambium  presentan las características citológicas típicas de las células meristemáticas, pero además son las únicas que pueden contener cloroplastos funcionales. Se originan a partir de la desdiferenciación de células parenquimáticas o de las colenquimáticas. Son células alargadas que se disponen en la corteza del tallo formando un cilindro continuo o a distintos niveles de profundidad desde la superficie formando placas.

Debido a estas características el crecimiento de callo se facilita ya que se podía obtener regeneración de plantas a partir de cultivos de tejidos
Los resultados obtenidos (generación de callo) dependen directamente de  la concentración de los reguladores de crecimiento

Se entiende por hormonas vegetales aquellas substancias que son sintetizadas en un determinado lugar de la planta y se translocan a otro, donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando el crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal. El término "substancias reguladoras delcrecimiento" es más general y abarca a las substancias tanto de orígenes naturales como sintetizados en laboratorio que determinan respuestas a nivel de crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.

Las fitohormonas son las moléculas responsables del desarrollo, aunque no se sabe bien cómo actúan en las células. Se sabe que su mecanismo de acción es por interacción con un receptor específico (la sensibilidad de un tejido hace referencia a su número de receptores), y que su modo de acción una vez recibida la señal es por transducción.
De la transducción se sabe poco, pero parece ser que no es muy diferente de la de los animales.
Las rutas de transducción traducen la señal en una respuesta.

La actuación depende de la sensibilidad del tejido y de la concentración de la hormona. Se denomina nivel activo de una hormona a las formas que desencadenan respuestas. Es necesario un control o homeostasis hormonal, importante para el control del crecimiento, defensa ante situaciones eventuales como cerrar constantemente los estomas en sequía.


AUXINAS

Son las primeras hormonas que se describieron. Su estructura es un derivado del fenol o el indol, y tienen anillos aromáticos con dobles enlaces conjugados. Todas son ácidos. Se descubrieron a partir del efecto de curvatura de los tallos al cortar su parte apical. No se sabe el modo de acción pero está relacionado directamente con su estructura, ya que si se modifica pierde su función. Las auxinas principales son:
-Ácido indolacético: es con la que más se ha experimentado.
-Ácido 4-cloroindolacético
-Ácido indolbutílico: actúa en el enraizamiento.
-Ácido fenilacético

Efectos

Los efectos de las auxinas son:

Crecimiento: estimulan la elongación celular en tallos y coleoptilos (tallos jóvenes), incrementan la extensibilidad de la pared celular y estimulan la diferenciación del xilema y el floema.

Tropismos: responsables del fototropismo y gravotropismo.

Dominancia apical: la yema apical del tallo (produce la mayoría de auxinas) inhibe el crecimiento de yemas axilares cercanas.

Abscisión de órganos (hojas, flores y frutos): posee un control genético, y las auxinas retrasan la caída, aunque el etileno la induce.

Rizogénesis: estimulan la formación de raíces laterales o adventicias. Inhiben la elongación de la raíz principal.

CITOCININAS

Son un grupo más reducido de hormonas que deben su nombre a su función (citoquinesis). En conjunto con las auxinas estimulan la división celular. Derivan de adeninas, y las más frecuentes son la quinetina y benciladenina (sintéticas) y la zeatina (natural). La zeatina posee un doble enlace en el centro de la cadena y tiene isómeros cis y trans que parecen ser formas naturales. La zeatina puede estar en la base siguiente al 3’ del anticodón del ARNt.

Efectos

Los efectos que producen son:

Crecimiento: en conjunto con las auxinas estimulan la proliferación de células meristemáticas, y también estimulan la expansión de los cotiledones tras el primer haz de luz que reciben.

Dominancia apical: estimulan el crecimiento de yemas laterales inhibiendo la apical (contrario a las auxinas, por lo que deben estar en equilibrio).

Diferenciación y morfogénesis: provocan cambios en la morfología según el tipo de crecimiento.
Junto a las auxinas estimulan la formación de raíces y tallos.

Senescencia: son anti-senescentes.

Las respuestas que se producen tras la aplicación de auxinas a las plantas dependen de la [hormona] así como del tipo de órgano tratado.

La [auxina] necesaria para estimular el crecimiento es menor en raíces que en brotes laterales, y ésta es menor que en brotes apicales.

Por lo tanto las concentraciones que se utilizaron deben de estar balanceadas para que el crecimiento sea óptimo por eso en los equipos 6 y 7 se observó un buen crecimiento. Pero no solo estos factores son relevantes si no que la buena esterilización el realizar el cultivo en condiciones óptimas cuenta mucho.

Si se contamina el cultivo el crecimiento será bueno pero no de lo que requerimos.
En general, el callo toma de 3 a 8 semanas para alcanzar el tamaño suficiente para efectuar un sub cultivo, como fue en este caso el cultivo en suspensión antes de que  el cultivo de callo estuviera en su ultima fase que es la de envejecimiento y perdida de crecimiento acelerado, para mantener la viabilidad de las células vegetales, es importante transferir tejido visiblemente sano (sin contaminación por hongos ni bacterias, sin necrosis).

No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan sólo se hace 8-10 veces.
Ocurre entonces lo siguiente:
- El medio nutritivo se agota y se seca.
- El material vegetal ocupa todo el tubo.
- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).
- El medio se hace líquido.

Aunque de forma natural los vegetales tienen un potencial endógeno para la formación de callo, pues su medio natural, al sufrir una lesión en un órgano, esta es reparada por este tejido. De especie a especie se presenta una variación en esta capacidad, misma que se refleja en la respuesta in vitro a la inducción de callo, encontrándose así tejidos para los que el aducirse  callo es requisito el suplemento de una auxina o un regulador de crecimiento relacionado; otros requieren solo una citocinina o un suplemento, tanto de auxina como de citocinina, o bien solo responden en presencia de extractos de complejos naturales en el medio.
                                                                                                                             
      a)Inducción:En esta etapa las células del inoculo inicial comienzan su crecimiento, tanto en numero como en tamaño.
Esta parte la observamos en la primera semana
      b) Proliferación celular:Durante esta fase el tejido calloso aumenta su masa celular al máximo.
Esta s se dio entre la segunda  a la cuarta semana del
      c) Inducción de la diferenciación: En esta fase se obtienen meristemos tanto apicales como radiculares, embrioides, tejido vascular, a partir de la masa celular del callo.
      d)Envejecimiento y pérdida  de la capacidad de crecimiento acelerado.

Las razones que dé a pesar que nuestro cultivo de callos fue optimo y nuestro cultivo de callo en suspension no resulto a pesar de que se utilizó las concentraciones de auxinas y citocininas que fueron las de mejor crecimiento provado experimentalmente, son varias.
Desde simples condiciones de no tener el ambiente adecuado de cultivo y que se contamino nuestro cultivo hasta como de que las células de callo ya no eran viables debido a su edad para el subcultivo.
Tampoco las células se pudieron disgregar y simplemente se quedaron como cumulo de células; debido a que el callo no era friable



CONCLUSIONES

Al comparar nuestros resultados con los de los demás equipos (obtención de una mejor calidad de callos) principalmente con los equipo 5 y 6  atribuimos los resultados a la concentración de reguladores hormonales presentes en el medio de cultivo, también contribuyen a un buen resultado el manejo adecuado de la técnica y materiales así como la edad de la zanahoria aunque estos factores no definen el resultado obtenido, y como el cultivo de callos es la base del cultivo en suspensión al no tener una buena calidad de callos refiriendo me a buena calidad que fueran esponjoso y en abundancia esto se reflejo en el cultivo en suspensión ya que aunque tuvimos una proporción adecuada de callo este era muy compacto lo que no permitió que se disgregar en el medio liquido y observáramos cúmulos de células después de 2 semanas de incubación con agitación.

Para que el callo pudiera crecer en condiciones idóneas era necesario tener un ambiente estéril para no tener competencia en el crecimiento de las células vegetales con otros microorganismos por los nutrientes. Muchos equipos no  obtuvieron callos sin contaminación y más aún, muchos ni siquiera obtuvieron callo porque desde un principio no trabajaron en las condiciones adecuadas.

Son muchos los efectos que intervienen en la buena obtención de un callo. Para empezar, se debe trabajar con un explante joven que tenga las células más totipotenciales o que tiendan con mayor facilidad a la totipotencialidad. Se debe trabajar en las condiciones adecuadas de esterilidad, asimismo, se debe cuidar el tiempo de desinfección de la zanahoria pues un tiempo mayor haría que penetrara el desinfectante al interior pudiendo dañar más células de las necesarias. Por último, es importante agregar las cantidades adecuadas de reguladores de crecimiento, tener un balance entre auxinas y citocinas pues ello determinará en gran medida que se dé o no la producción de callo.

Un balance correcto de citocinas y auxinas nos dará lugar a la producción de un buen callo. Un buen callo es aquél que tiene las características de esponjosidad, friabilidad, tamaño y textura adecuada. Para poder obtener un cultivo en suspensión de un callo es necesario que sea lo más friable posible para conseguir una adecuada disgregación celular. No se logró disgregar muy bien a las células en el matraz pero se pudo al menos ver la presencia de las mismas en agregados pequeños de células.


BIBLIOGRAFIA

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- http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm

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