lunes, 30 de marzo de 2015

Capacidad del medio TSB para producir medio de cultivo de Bacillus subtilis

OBJETIVOS

·         Determinación de la capacidad del medio soya tripticaseína para permitir el crecimiento de Bacillus subtilis.
·         Probar la esterilidad de un producto farmacéutico estéril en el medio soya tripticaseína.

INTRODUCCIÓN

El medio soya tripticaseína (Tryptic Soy Broth, TSB) es un medio líquido para enriquecimiento de uso general utilizado en procedimientos cualitativos para la prueba de esterilidad y para el enriquecimiento y cultivo de microorganismos aerobios no exigentes en exceso. Debido a su capacidad para favorecer el crecimiento, ésta fórmula fue adoptada por la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) como medio de prueba de esterilidad.

Las pruebas de esterilidad tienen como finalidad investigar la presencia de microorganismos contaminantes en sustancias, preparaciones o dispositivos médicos que de acuerdo con la Farmacopea requieren ser estériles. Esta prueba, por si misma, no asegura que un lote de producto sea estéril, esto solo se logra con la validación de los procesos de esterilización y de llenado aséptico (FEUM, Vol. I, 10ª ed.).

Bacillus subtilis es el microorganismo gram positivo mejor caracterizado (Kunst et. al., 1997). Bacillus subtilis contiene la enzima catalasa KatA y MrgA, la cual es la responsable de la catálisis del peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno (Ucar, 2013). Tiene la habilidad de formar endosporas de protección, permitiéndole soportar condiciones extremas. Había sido clasificada como aerobia obligada, sin embargo, se ha mostrado que puede ser anaerobia bajo ciertas condiciones (Nakano et. al., 1998). La morfología colonial de Bacillus subtilis se caracteriza por colonias planas, color mate y un aspecto de vidrio esmerilado en TSB (Forbes et. al., 2009). Esta bacteria  no es patógena y es utilizada ampliamente en sector alimenticio y farmacéutico cómo productora de amilasas, proteasas, aminoácidos y de la bacitracina A (antibiótico  para bacterias gram positivas).

Algunas especies del dominio Bacteria producen en el interior de sus células estructuras especiales llamadas endosporas durante un proceso denominado esporulación. Las endosporas son células diferenciadas extraordinariamente resistentes al calor y difíciles de destruir, incluso por agentes químicos muy agresivos. Las bacterias que forman endosporas se encuentran habitualmente en  el suelo. Entre las bacterias formadoras de endosporas, los géneros mejores conocidos son Bacillus y Clostridium. Las endosporas son también resistentes a otros agentes como la desecación, la radiación, los ácidos y los desinfectantes químicos y pueden permanecer en estado de latencia durante períodos de tiempo muy largos (Madigan et. al., 2009).

En 1981 se colocó en un medio de cultivo una suspensión de esporas de Clostridium aceticum preparada en 1947 y, 34 años después, comenzó a crecer en menos de 12 horas dando lugar a un cultivo. En 1955 un grupo de científicos publicó la resurrección de endosporas bacterianas cuya edad se estimaba en 25-40 millones de años. Supuestamente éstas esporas fueron preservadas en los intestinos de una abeja extinguida atrapada en ámbar. La presencia de bacterias formadoras de endosporas en éstas abejas se habías sospechado ya en estudios de microscopía electrónica del intestino de insectos que tenían estructuras parecidas a las endosporas y en los que se había recuperado DNA parecido al de Bacillus (Madigan et. al., 2009).


METODOLOGÍA


1) Generar de biomasa (antes de obtener esporas, se debe obtener biomasa que se someterá a condiciones especificas para la formación de esporas).

2) Cosechar la biomasa. Es decir, separar el intermediario (biomasa) del medio de cultivo. (condiciones de esterilidad).


3) Suspensión de la bacteria (Bacillus subtilis) en solución salina.

-Mantener la presión osmótica entre el medio y la célula.
-Las células contienen entre 80 y 90% de agua.
-El medio donde crecen las células contienen baja cantidad de sales.

4) Calentamiento de Bacillus subtilis a 70ºC por 30 minutos.
- A los 70ºC Bacillus subtilis es destruida.
-Sus endosporas resisten esta temperatura.

Endosporas bacterianas:
-Estructuras esféricas u ovales.
-Estado latente (o de reposo) en el ciclo de crecimiento de la bacteria.
-Se forman en respuesta a la carencia nutricional dentro de la célula bacteriana.

5) Centrifugado y lavado de la pastilla celular.
Separar componentes celulares.
Selección de esporas viables, entre esporas con poca probabilidad de resistir y células vegetativas
(Franklin, Clark, 1981).


6) Determinación turbidimétrica.
-El cultivo de bacterias actúa como una suspensión coloidal que intercepta la luz a través de ellas.
-La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la concentración de células.
-Mientras mas alto sea el porcentaje de transmitancia, más bajo es el numero de células en suspensión.


Composición del TSB (Tripticase soy broth)

RESULTADOS


Figura 1. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-1.

Figura 2. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-2.

Figura 3. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-3.

Figura 4. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-4.

Figura 5. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-5.

Figura 6. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-6.

Figura 7. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para la dilución 10-7.

Figura 8. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en medio soya tripticaseína para muestra de suero marca Suerox ®.

Tabla 1. Resultados generales obtenidos del crecimiento de B. subtilis en las diluciones de medio soya tripticaseína y de un preparado farmacéutico estéril.
Tubo/Dilución
24 horas
48 horas
72 horas
4 días
7 días
10-1
+
++
+++
++++
++++
10-2
-
+
++
+++
+++
10-3
-
+
++
+++
+++
10-4
-
+
++
+++
++++
10-5
-
+
+
+++
+++
10-6
-
+
+
++
+++
10-7
-
+
+
++
+++
Suerox®
-
-
-
-
-
*++++=opaco, denso  +++=opalescente, denso   ++=opalescente   +=leve crecimiento

Figura 9. Monitoreo del crecimiento de Bacillus subtilis en agar nutritivo para verificar la viabilidad de las esporas.

DISCUSIÓN

Justificación del método

1)      Generación de biomasa: antes de obtener las esporas se debió general biomasa y luego cosechar. Se sembró en caldo nutritivo y se incubó a 37ºC porque Bacillus subtilis es mesofílica. Además se agitó a 200 rpm para permitir la aireación por ser una bacteria aeróbica y para homogeneizar el cultivo.
2)      Cosecha de biomasa: debieron ser condiciones estériles para evitar la contaminación incluso con otras cepas de Bacillus subtilis. Además, se aseguró un  posterior  lavado celular en centrifugación para eliminar los restos del medio caldo nutritivo, esto para evitar interferencias al momento de pasar a soya tripticasa.
3)      Suspensión de B. subtilis en solución salina: para mantener la presión osmótica entre el medio y la célula. Una concentración de 0.85% de NaCl fue empleada. Con ello se evita la plasmólisis o lisis celular, según sea el caso.
4)      Calentamiento de B. subtilis a 70ºC por 30 minutos: se hizo para causar estrés celular. A 70ºC Bacillus subtilis es destruida mientras sus endosporas resisten bastante bien ésta temperatura y son activadas (véase Bacillus subtilis y formación de endosporas).
5)      Centrifugado y lavado de la pastilla celular: para eliminar los componentes del medio. Se suspende en agua estéril para causar la lisis celular y eliminar B. subtilis de la ecuación, dejando solo las endosporas.
6)      Agitación con perlas de vidrio: para ayudar a romper la pared celular y liberar las endosporas, así como disgregar los cúmulos de Bacillus que pueda haber.
7)      Determinación turbidimétrica: el cultivo de B. subtilis actúa como una suspensión coloidal que impide el paso de luz dependiendo de la concentración. Mientras más alto el % de transmitacia, más bajo el número de células presentes. Se ajustó a 58.8% de transmitancia.


Medio soya tripticaseína

El medio soya tripticaseína se usa para el cultivo tanto de microorganismos exigentes como no exigentes. Dadas sus capacidades nutrimentales puede ser usado como medio de enriquecimiento como un medio sangre.

Tabla 2. Fórmula por litro de agua destilada para la preparación del medio soya tripticaseína. Se debe llevar a autoclave a 121ºC por 15 minutos para esterilizar.
Componente
Cantidad (g)
Digerido pancreático de caseína
17.0
Digerido papaico de harina de soya
3.0
Dextrosa
2.5
Cloruro de sodio
5.0
Fosfato dipotásico de hidrógeno
2.5

La Tabla 2 muestra los componentes del medio. El digerido pancreático de caseína contiene todos los aminoácidos presentes en la caseína así como fracciones de péptidos. La caseína es una fosfoproteína de composición variable y difícil de determinar, sin embargo se agrupan en cuatro grandes grupos dada su movilidad electroforética, αs1, αs2, β y κ. Para hacer el digerido pancreático de caseína se tiene primero que disolver ésta convirtiéndola en su sal (precipita a pH=4.6 y es bastante insoluble en agua en su forma no ionizada).

El digerido papaico de harina de soya contiene peptonas que aportan de aminoácidos esenciales para el crecimiento de microorganismos. La papaína tiene actividad tanto exo como endo-peptolítica, por lo que se obtiene gran variedad de derivados peptídicos. Tanto el digerido pancreático de caseína como el digerido papaíco de soya son fuente de nitrógeno para el microorganismo. Además, éste último contiene altas concentraciones de vitaminas y carbohidratos.

La dextrosa actúa como fuente de carbono mientras que el fostato dibásico de potasio provee de una solución buffer para mantener el pH alrededor de 4.5-5.0.

El cloruro de sodio sirve para mantener el balance osmótico y debe estar a una concentración isotónica (0.85-0.90%), en éste caso está a (5/1030) *100%= 0.5%. Sin embargo el digerido pancreático de caseína contiene la cantidad faltante de iones Na+.

Para verificar las propiedades nutritivas de cada medio de cultivo se utilizan cepas de microorganismos muy exigentes visto desde el punto de vista de las necesidades nutritivas y de las condiciones de aerobiosis-anaerobiosis (Caro y Cruz, 2006). De acuerdo con la Figura 10, se pueden observar algunas cepas que cumplen con el requisito anterior.



Bacterias aeróbicas
Cepas
Staphylococcus aureus
NBRC13276
ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIB 9518
Bacillus subtilis
ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacterias anaeróbicas

Clostridium sporogenes
NBRC 14293
ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532
Fungi

Candida albicans
ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis
ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007 , NBRC

Figura 10. Microorganismos utilizados para las pruebas de esterilidad para productos farmacéuticos, según la International Pharmacopeia (2013).

Bacillus subtilis y formación de endosporas

Una vez que se conocen las características del medio, se pueden verificar las particularidades de la cepa que se utilizó en esta corrida experimental. Bacillus subtilis se distingue por ser una bacteria gram positiva , crece a un rango de temperatura de 25 a 37oC, es aerobia sin embargo; puede crecer como aerobia facultativa, e. g.;  en condiciones aerobias aparte de requerir oxígeno, utiliza nitratos como fuente de carbono para completar la respiración celular; mientras que induciendo su crecimiento como aerobio facultativo, la célula requiere de nitrito como un aceptor final de electrones (EPA, 2013).

De acuerdo con el método publicado por los autores Franklyn y Clark, (p. 1-4, 1981) para la obtención de esporas de Bacillus subtilis, se debe promover el crecimiento de la biomasa, paso que se realizó en el desarrollo experimental (el cual consistió en inocular con la cepa y dejar crecer 48 h). El siguiente paso es cosechar la biomasa, para cual se basa en la separación de biomasa por una fuerza centrífuga.
Aunque todo el procedimiento se realizó en condiciones asépticas,  se sembró un inóculo del último paquete celular que se obtuvo, el resultado se presenta en la tabla 9 en el primer cuadro, dichas colonias presentan aspecto plano y de color mate, comparando con  lo reportado por Forbes, Samh y Weisfeld (p. 285, 2009) corresponde al microorganismo utilizado en la práctica.

Durante la formación de endosporas Bacillus subtilis se convierte en una estructura inerte y termoresistente. La esporulación supone una compleja serie de procesos de diferenciación celular. La esporulación bacteriana no se produce durante el crecimiento exponencial sino únicamente al cesar el crecimiento como consecuencia de la limitación de un nutriente esencial, por ello se suspendió la cepa en solución salina fisiológica.

La conversión de una célula vegetativa en endospora se basa en muchos cambios en la expresión de los genes de la célula como se muestra en la figura siguiente:

Figura 11. Fases en la formación de una endospora bacteriana (enumeradas del 0 al VII) han sido definidas tanto a partir de estudios genéticos como de análisis microscópicos.

En Bacillus subtilis el proceso de esporulación dura 8 horas y se ha estudiado con detalle. Mediante estudios genéticos con mutantes de Bacillus  se ha demostrado que hay alrededor de 200 genes implicados en el proceso. La esporulación requiere el cese de la síntesis de algunas proteínas funcionales en la célula vegetativa y la síntesis de nuevas proteínas específicas.

Figura 12. Micrografía de fluorescencia de una célula de Bacillus subtilis en el proceso de esporulación. La zona verde se debe a un colorante que tiñe específicamente una proteína en la cutícula de la endospora.

La endospora es capaz de permanecer en estado de latencia por años o siglos, y pueden dan lugar a la aparición de una célula vegetativa de modo relativamente rápido. La activación se realiza fácilmente por el calentamiento de las endosporas recién formadas durante varios minutos a una temperatura subletal pero elevada (70ºC y 30 minutos en éste experimento). Las endosporas activadas quedan así condicionadas a germinar cuando se colocan en presencia de los nutrientes adecuados. La germinación es normalmente un proceso rápido que ocurre en cuestión de minutos y supone la pérdida de refrigencia de la espora y la pérdida de la resistencia al calor y a sustancias químicas.

Figura 13. Germinación de una endospora de Bacillus: conversión de la endospora madura (a) a una célula vegetativa (d). Las micrografías muestran la secuencia de los procesos que se inician con la espora refringente. En la activación (b) se pierde la refractabilidad, mientras que en (c) y (d) se aprecia la emergencia de la nueva célula vegetativa (crecimiento).

Crecimiento en los tubos a las diluciones dadas

Tabla 3. Resultados esperados de crecimiento de Bacillus subtilis –y otras cepas no ensayadas en éste experimento- en soya tripticaseína según la Farmacopea Europea.
Cepa de prueba
Resultados de crecimiento esperados (turbidez)*
Staphylococcus aureus ATCC 6538
+++ o más
Bacillus subtilis ATCC 6633
+++ o más
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
+++ o más
Candida albicans ATCC 10231
+++ o más
Aspergillus niger ATCC 16404
+++ o más
Sin inocular
Ámbar claro a mediano, transparente, sin precipitación
*++++=opaco, denso  +++=opalescente, denso   ++=opalescente   +=leve crecimiento

Según la Farmacopea Europea los recipientes inoculados debían ser incubados a 30-35ºC durante un período máximo de 3 días. Para la práctica incubamos a 37ºC por un período de 7 días monitoreando cada 24 horas los tubos. De cualquier forma la Farmacopea Europea indica que se debían airear los recipientes ya sea aflojando ligeramente la tapa o introduciendo una aguja de jeringa estéril tapada con algodón estéril. En nuestro caso, no aireamos los recipientes. Además la EP indica que para medios mayores a 5 mL el inóculo  debe ser de 0.75 mL, no de 1.0 mL como hicimos.

De acuerdo con el Nefelometro de McFarland una densidad óptica de 1 corresponde a 8x1010 UFC/mL. Ya que nosotros ajustamos a 58.8% de transmitancia podemos calcular a cuántos UFC/mL corresponde éste valor.


Sabemos que para una celda de 1 cm de grosor DO=Abs y además que la absorbancia tiene un comportamiento lineal respecto a las concentraciones para soluciones diluidas:

Por lo tanto para un 58.8% de transmitancia teníamos 1.8x1010 UFC/mL.

Tabla 4. Concentraciones de Bacillus subtilis en cada uno de los tubos de dilución en agua destilada.
Dilución
UFC/mL
100
1.8x1010
10-1
1.8x109
10-2
1.8x108
10-3
1.8x107
10-4
1.8x106
10-5
1.8x105
10-6
1.8x104
10-7
1.8x103
10-8
1.8x102
*Los tubos 10-1-10-7 se sembraron en medio soya tripticaseína, mientras que 10-5-10-8 se inocularon sólo en las placas de agar nutritivo.


Tabla 5. Respuesta del cultivo esperada por la USP/EP/JP a las temperaturas y tiempos de incubación requeridos por cada una de las farmacopeas.
Microorganismo
Inóculo (UFC/mL)
Período de incubación
Crecimiento esperado
Aspergillus niger ATCC 16404
10-100
5 días
Crecimiento
Bacillus subtilis ATCC 6633
10-100
18-72 horas
Crecimiento
Candida albicans ATCC 10231
10-100
18-72 horas
Crecimiento
Staphylococcus aureus ATCC 25923
10-100
18-72 horas
Crecimiento bueno a excelente
Stahylococcus aureus ATCC 6538
10-100
18-72 horas
Crecimiento

Según las tablas 4 y 5 la única dilución que cumplía con las especificaciones de la Farmacopea Europea era la dilución 10-8, pues aunque el inóculo mostrado en la Tabla 4 tiene una concentración de 180 UFC/mL debe considerarse que se inocularon 1 mL en 9 mL de medio, por tanto la concentración en el medio soya tripticasa debió ser 18 UFC/mL, que está dentro del rango de 10-100 como indica la Tabla 5.

Sin embargo, no sembramos en soya tripticasa para la dilución 10-8 por falta de tubos. Por tanto sólo podemos considerar como aproximado el tubo 10-7 en el que se debe observar un crecimiento de +++ a los 3 días del experimento según la EP. La Tabla 1 nos dice que a las 72 horas se tuvo un crecimiento de +. Se podría argumentar que no cumple con la especificación de la farmacopea pero no se tienen en cuenta tres factores importantes.

Primero que el comportamiento de Abs vs concentración podría no ser lineal a éste intervalo, y por tanto, tratarse de menor cantidad de microorganismo en el tubo 100 del que se piensa.

Segundo que la Farmacopea Europea requiere que se airee el medio, ya sea introduciendo un tapón de algodón o aflojando la tapa del tubo ligeramente. No se hizo y dado que Bacillus subtilis es mayoritariamente aerobia esto debió haber dificultado el crecimiento del microorganismo.

Y tercero que la determinación cualitativa que proponen las tres farmacopeas consultadas (USP/EP/JP) –Tablas 3 y 5- se basa en datos referentes a los otros microorganismos de prueba que ya se mencionan en las tablas, por lo que se tuvo que hacer un cultivo de éstos para tener una referencia de qué tanto es ++++ y qué tanto es +. Además el método se presta mucho a la subjetividad del investigador.

Por tanto según estos tres factores, recomendamos que:
·         Se haga una curva tipo para la determinación exacta de la concentración de microorganismos en la muestra problema.
·         Se afloje la tapa del tubo o se ponga un tapón de algodón en lugar de una tapa de plástico que impide el intercambio de aire.
·         Se especifique claramente con referencia a otros microorganismos qué tanto es un crecimiento ++++ y qué tanto un es un crecimiento +.

Crecimiento en placas Petri

La Figura 9 muestra los resultados del crecimiento de las diluciones 100,, 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8. Se observó crecimiento masivo en la siembra del inóculo como cabría esperarse considerando la cantidad de microorganismos presentes según la Tabla 4 de 1.8x1010 presentes en ésta dilución. Para el caso 10-5 sólo se observan 2 UFC presentes. 10-6 muestra una única colonia. 10-7 muestra un inesperado crecimiento masivo. Sugerimos que esto es debido a una confusión en los tubos 10-1 y 10-7 debido al parecido gráfico entre ambos números y a la dificultad de etiquetar un tubo de ensaye con plumón. 10-8 no muestra crecimiento de microorganismos. También, aunque tratamos que las muestras para hacer las diluciones fueran lo más homogéneas posibles podrían haberse formado cúmulos de Bacillus que la punta de la pipeta pudo o no tomar, dando lugar a los resultados anómalos mostrados.


Prueba de esterilidad

Las pruebas de esterilidad en los productos farmacéuticos representan, en gran medida una forma de demostrar la seguridad de dicho producto. La  USP (Farmacopea de los Estados Unidos o United States Pharmacopeia) para asegurar la calidad del producto en relación a contaminación microbiana, aplica dos tipos de ensayos para determinar microrganismos aerobios y anaerobios.

El fundamento de la prueba de esterilidad consiste en establecer un procedimiento para valorar la presencia o ausencia de microorganismos aerobios y/o anaerobios facultativos viables (bacterias, hongos y levaduras) en cada producto final. Para realizar la prueba,  se necesita más de un medio de cultivo que demuestre tener propiedades nutritivas para favorecer el crecimiento (Caro y Cruz, 2006). Es por esta razón que órganos reguladores como la USP y la International Pharmacopeia reportan los siguientes medios para ejecutar estos ensayos: medio fluido de tioglicolato y  soya tripticasa.

Según la Figura 8 no hay crecimiento para el producto farmacéutico elegido. En éste caso elegimos Suerox® para probar si se trataba de un producto estéril o no. La FEUM exige que las soluciones electrolíticas tengan menos de 100 UFC/mL de microorganismos mesofílicos aerobios, como Bacillus subtilis. Por tanto, según la prueba, la marca suerox si cumple con las especificaciones de la FEUM, además que se trata de un producto farmacéutico estéril según la prueba realizada. Esto no tiene que ser así, pues la FEUM lo clasifica como un preparado de clase 3. Sin embargo, la marca PEDYALITE ofrece explícitamente sueros orales estériles en su etiqueta.


CONCLUSIONES

·         Se comprobó que el medio de cultivo soya tripticasa es viable para permitir el crecimiento de Bacillus subtilis.
·         El suero oral de la marca Suerox® es estéril bajo la normativa de la USP.
·         Se deben aflojar ligeramente los recipientes de las diluciones del cultivo en soya tripticasa de Bacillus subtilis para permitir la aireación del medio.
·         No se pudo hacer el conteo en placa para la determinación de las UFC/mL en las diluciones 10-5-10-8.
·         Se debe tener especial cuidado a la hora de etiquetar los tubos para evitar confusiones.
·         Se logró la formación de endosporas en Bacillus subtilis sometiendo el microorganismo a condiciones de estrés térmico de 70ºC por 30 minutos.

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