sábado, 9 de junio de 2012

La medusa inmortal: Morfología de Turritopsis nutricula


Análisis morfológico y ultraestructural de Turritopsis nutricula durante el ciclo reverso de vida



E.C. Carla’, P. Pagliara, S. Piraino, F. Boero, L. Dini

Department of  Biological and Environmental Science and Technology, University of Lecce, Via per Monteroni,  73100 Lecce, Italy

Resumen: El ciclo de vida de un Hidrozoo esta caracterizado en condiciones normales por la alternancia de un pólipo béntico post larvario y una medusa pielágica adulta; sin embargo, algunas especies de hidrozoos reaccionan al estrés ambiental revirtiendo su ciclo de vida, esto es, una medusa adulta regresa al estado juvenil de pólipo. Este raro ciclo de vida puede ser considerado como una especie de metamorfosis inversa. Un estudio morfológico de los diferentes estados durante el estado reverso del ciclo de vida de Turritopsis nutricula nos llevó a la caracterización de cuatro diferentes estados: healthy medusa, unhealthy medusa, four-leaf clover y cyst. El estudio ultraestructural de los cambios celulares (durante el ciclo reverso de T. nutricula)  mostró la presencia tanto de un proceso degenerativo como apoptótico. La degeneración fue prevalente durante los estados de unhealthy medusa y for-leaf clover, mientras que el proceso apoptótico fue mayor durante los estados de healthy medusa y cyst. La presencia significativa de procesos degenerativos y apoptóticos podría estar relacionado con una especie de suceso de metamorfosis cuando una medusa adulta se convierte en un pólipo.

Keywords: Hydrozoa, Apoptosis, Lectin-binding sites



Introducción

El ciclo de vida de un Hidrozoo esta caracterizado en condiciones normales por la alternancia de un pólipo béntico post larvario y una medusa pielágica adulta, pero en algunas especies se puede observar una reducción o supresión del estado de pólipo o medusa (Boero y Bouillon, 1993). En un ciclo completo, la medusa madura libera los gametos dentro del agua, donde la fertilización se lleva a cabo, mientras que en especies sin el estado de medusa los gametos se desarrollan en estructuras especiales (gonóforos). Después de un corto período de vida libre, la plánula larvaria resultante se asienta y metamorfosea en un pólipo béntico. Durante la metamorfosis se activan sistemas que inicialmente deben eliminar todas las partes del cuerpo que ya no son necesarias. Después de ello, se alcanza un distintivo punto de inflexión, seguido por el subsecuente desarrollo de características que finalmente dan lugar a un pólipo primario (Seipp et. al., 2001). De éste pólipo brotan otros pólipos y forman una colonia, pero pueden también brotar medusas que se desprendan de la colonia para llevar una vida libre hasta que los gametos son liberados, después de lo cual mueren.

En un ciclo de vida normal, el estrés (cualquier factor que cause cambios en el sistema biológico), que es potencialmente dañino y cuyos efectos pueden ser letales o sub-letales, es considerado una desventaja para los animales. Sin embargo, el estrés no es siempre perjudicial y puede desencadenar distintas respuestas biológicas diferentes; de hecho, una variedad de respuestas de estrés se han medido en los sistemas biológicos expuestos a diversos tipos e intensidades de factores de estrés (Karlin y Bocchieri, 1998; Kregel, 2002).

Dentro de los Hidrozoos, algunas especies parecen ser capaces de reaccionar al estrés en una forma inesperada: la medusa regresa ontogenéticamente a un pólipo, generalmente considerada como una etapa juvenil (Boero et. al., 1997). Turritopsis nutricula fue la primer especie de Hidrozoo descrita capaz de revertir su ciclo de vida (Bavestrello et. al., 1992). Los autores argumentaron que la reversión ocurre únicamente en medusas jóvenes y no en medusas sexualmente maduras. La medusa, bajo condiciones de estrés, revierte a un estado de pólipo. Durante esta reversión celular se necesita reorganización pues las células diferenciadas vuelven al estado indiferenciado para cambiar su función (Piraino et. al., 1996). En efecto, mediante la aplicación de diferentes tipos de estrés (cambios en la temperatura, salinidad, concentración de oxígeno, falta de alimento) se indujo la reversión y se demostró que un grupo de células indiferenciadas en la medusa produjo un pólipo. Ésta propiedad también se ha observado durante el desarrollo indirecto, cuando células indiferenciadas retienen su potencial para dividirse indefinidamente y así formar grandes estructuras (Davidson et. al., 1995; Peterson et. al., 1997).  Sin embargo, se pueden citar diferentes mecanismos de acción para explicar el ciclo revertido en T. nutricula, por ejemplo, algunas células diferenciadas también pueden participar en la reconstrucción del pólipo, mediante la activación de un proceso similar a la metamorfosis.

La metamorfosis ocurre generalmente en aquellas especies  caracterizadas por el desarrollo indirecto. Durante este período, en el que la larva se transforma en un adulto, se han descrito para una amplia gama de especies, como anfibios e insectos, procesos tanto degenerativos como apoptóticos (Vogt, 1842; White et al., 1994; Truman, 1984; Sanders and Wride, 1995). La apoptosis o muerte celular programada es un proceso fundamental para el desarrollo correcto así como para el mantenimiento de la integridad del organismo mediante la destrucción de células que son potencialmente dañinas. Este proceso puede ser importante para definir la estructura del cuerpo del pólipo generado durante el ciclo inverso de T. nutricula.

El presente trabajo describe un estudio morfológico de diferentes etapas durante el ciclo de vida de T. nutricula, dando evidencia de procesos degenerativos y apoptóticos, así como la capacidad de la medusa madura de invertir su ciclo de vida.

Materiales y métodos

1.    Muestras

Las colonias de hidrozoos fueron recogidas por buceo cerca de las Islas Cheradi (Mar Piccolo de Taranto, Italia) durante finales de verano y otoño (de agosto a noviembre) de 1999. Las colonias se mantuvieron en agua de mar aireada e identificadas en el laboratorio mediante un estereoscopio (Leica MZ12).

Las colonias fértiles de T. nutricula fueron aisladas y mantenidas en agua de mar filtrada (FSW) a 22°C. Las nuevas generaciones de medusa fueron aisladas y alimentadas con nauplios de Artemia, con cambios diarios de FSW.  Se aplicaron diversas fuentes de estrés para verificar la capacidad de la medusa de reaccionar y trasnformarse, mediante la reorganización de ella misma, en un pólipo. Se hicieron escisiones con tijeras de la sombrilla de la medusa, se elevó la temperatura a 30°C durante 30 min o se redujo la concentración de oxígeno mediante la adición de una gran cantidad de Nauplia.

2.    Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Diferentes etapas de T. nutricula fijadas con glutaraldehído al 2.5% en una solución de agua de mar durante dos horas a temperatura de hielo y lavadas tres veces con FSW. La post-fijación se realizó con 1% en OsO4 en FSW durante 1 hora.  Las muestras fueron lavadas varias veces en FSW y deshidratadas con una concentración cada vez mayor de alcohol durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación embebida en resina epoxi. Se tiñeron con acetato de uranio y citrato de plomo secciones ultrafinas y fueron examinadas en un TEM Philips CM12.

3.    Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Se fijaron en glutaraldehído al 2.5% diferentes etapas de T. nutricula y después de fijaron en 1% de OsO4 en FSW como se describió anteriormente. Se deshidrataron con acetona y desecaron con un CO2 Critical Point Dryer 020 (Balzer, Liechtenstein) rociada con oro (Coated 040 Balzer) y se observaron a través de un microscopio de barrido Philips XL50.

4.    Microscopía confocal

Las diferentes etapas de T. nutricula fueron fijadas en una solución buffer al 4% de paraformaldehído y emebidas en parafina; se analizaron secciones de 3 micrómetros de espesor usando lectinas FITC conjugadas. Las lectinas usadas fueron las siguientes (las concentraciones y las especificaciones de azúcar aparecen entre paréntesis): Ulex europaeus (40 microgramos/mL, alfa-fructusa); Concanavlin-A (ConA; 20 microgramos/mL, manosa); Ricinus (2 microgramos/mL, beta-galactosa). Todas las lectinas se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, USA).

La presencia superficial de azúcar se investigó mediante el uso de un microscopio Nikon 2000 CPM (Nikon, Japón) con los objetivos Plan Fluor (Nikon, Japón). LA microscopía confocal se realizó utilizando un láser confocal de barrido cabeza Nikon PCM 2000 basado en un microscopio Nikon Eclipse 600. La adquisición y la visualización estuvieron completamente controladas por computadora con el software EZ 2000 (Coord-Nikon, Países Bajos).

5.    Microscopía óptica

Se tiñeron con azul de toluidina y tinción de plata secciones semi-delgadas de las mismas muestras embebidas de TEM. Para una mejor evaluación de los núcleos apoptóticos, también se llevó a cabo tinci´n de plata en las secciones mediante el uso de una mezcla de nitrato de plata  (3 microgramos/mL) y hexametilentetramina (75 microgramos/mL).



Resultados

La Turritopsis nutricula fue capaz de sobrevivir a diferentes tipos de estrés mediante una reorganización de sus tejidos adultos a una forma juvenil. El tipo de estrés más reproducible capaz de desencadenar la reversión del ciclo de vida fue  la exposición de la medusa a mayores temperaturas (30°C) que lo normal (22°C). Bajo éstas condiciones, 80% de las medusas activaron la reversión de su ciclo de vida.

Por medio de la observación estereoscópica, se identificaron cuatro etapas fáciles de distinguir del ciclo inverso de vida, a las que llamamos: healthy medusa, unhealthy medusa, four-leaf clover y cyst. La micrografía óptica de la figura 1 muestra su diferente morfología macroscópica.


Fig. 1. Ciclo de vida de Turritopsis nutricula: a) healthy medusa, b) unhealthy medusa, c) four-leaf clover, d) cyst, e) pólipo. La doble flecha indica el punto de  reversión del ciclo.


Cada etapa tenía las siguientes características: la healty medusa tenía una umbrella en forma de campana con tentáculos largos y nadaba activamente (Fig. 2a). La unheatly medusa no era capaz de nadar y mantenía sus tentáculos en una posición retraída, también había perdido la transparencia típica de la healty medusa (Fig. 3a). La etapa four-leaf se caracterizaba por la ausencia de tentáculos, por la reducción de la cavidad sub-umbrella la que mostró una serie de lóbulos y muchos procesos degenerativos (Fig. 4a y b). El estado cyst tenía una forma esférica y una superficie lisa (Fig. 5a), era capaz de conectar al sustrato y rápidamente dio lugar a un pólipo morfológicamente similar a los generados durante el ciclo de vida normal.
Tabla 1. Actividades apoptóticas y necróticas en las diferentes etapas del ciclo de vida inverso de T. nutricula.


Por medio de luz, fluorescencia, escaneo y microscopía electrónica de transmisión se observó la morfología microscópica de los cuatro estados con el fin de analizar las modificaciones morfológicas a nivel celular. En la healthy medusa (Fig. 2), se observó una gran cavidad sub-umbrella con un manubrio (Fig. 2a y b). La umbrella estaba delimitada externamente por una capa ectodérmica, echa por células planas conectadas entre sí por pequeñas protuberancias citoplasmáticas (Fig. 2c, flecha). En éstas células eran abundantes mitocondrias, gotas de glicógeno y retículos endoplasmáticos lisos y rugosos. También se detectaron células epiteliales de músculo estriado (Fig. 2d). Se reconocieron las gónadas y la cavidad gástrica en comunicación con los canales radiales (Fig. 2e). El estudio ultraestructural de manubrio reveló una organización muy compleja, con muchos citotipos morfológicamente diferentes: en particular, células musculares con fibrar radialmente orientadas y células glandulares (Fig. 2f). Las células apoptóticas también estaban presentes en el manubrio (Fig. 2g y h).

Fig. 2. Healthy medusa. a) Imagen estereoscópica de una medusa que muestra la sección plana, b) Sección semi-delgada de una medusa tratada con azul de toluidina (ampliación 20x), c) Células de umbrella con pequeñas protuberancias (flecha) (ampliación 6500x), d) células epiteliales y musculares con sarcómeros claramente visibles (flecha) (ampliación 7000x), e) Sección semifina del manubrio que muestra las gónadas, f) ampliación de las células de las gónadas en EM (ampliación 5000x), g) las células de manubrio, “GL” célula glandular, “MC” sección trasnversal de célula muscular (ampliación 3000x), h) células apoptóticas (el núcleo con cromatina condensada) dentro del manubrio (ampliación 5000x).



Fig. 3. Unhealty medusa. a) Imagen estereoscópica de la unhealthy meudsa, b) micrografía SEM de unhealthy medusa que muestra la retracción de tentáculos (ampliación 2000x), c) células de manubrio que muestran dos células que se han empezado a separar (flecha) (ampliación 4000x), d) células de umbrella con el citoplasma dañado. Una célula epiteliar muscular muestra una reducción de las fibras estriadas (flechas) (ampliación 4500x), e) células ectodérmicas de manubrio, el citoplasma no tiene organelos intracelulares (ampliación 5000x), f) células endodérmicas de manubrio con citoplasmas ricos en electrones (ampliación 3500x), g) células endodérmicas de manubrio. Las células son redondas y han perdido contacto una con otra. Muestran algunos signos de necrosis (asterisco) (ampliación 5000x), h) e i) células apoptóticas dentro del manubrio; h: etapa inicial de la apoptosis con condensación de cromatina y cisterna nuclear alargada (ampliación 5000x); i: estado necrótico de apoptosis (ampliación 6500x).
En la unhealty medusa (Fig. 3) los tentáculos y la cavidad sub-umbrella estaban reducidas. Las células de la umbrella mostraron muchas vacuolas grandes vacías (Fig. 3c); muchos sarcómeros y mitocondrias estaban todavía presentes en las células epiteliales del músculo, aunque se observó una alteración dramática de su morfología (Fig. 3d). Se encontraron aún más modificaciones en el manubrio: las células perdieron sus contactos celulares pero mantuvieron sus contactos de unión (Fig. 3e, punta de flecha). Las células ectodérmicas tenían pocos orgánulos citoplasmáticos; las células ectodérmicas eran redondas; en el citoplasma estaban presentes grandes vacuolas con alta densidad de electrones (Fig. 3f). Algunos de estas células mostraron señales claras de degeneración (Fig. 3g), probablemente debidas a los fenómenos líticos, mientras que otras células mostraban características típicas de apoptosis (Fig. 3h e i). Sin embargo el número de células apoptóticas fue menor que en la healthy medusa (Tabla 1). Se perdieron el contenido intracelular y de la mesoglea.

En la etapa four-leaf clover, el daño morfológico descrito para la unhealty medusa se hizo más evidente. De hecho, el estrés indujo la total desaparición de los tentáculos (Fig. 4a) y una regresión del a umbrella, dando como resultado una cavidad sub-umbrella aún más irregular y restringida (Fig. 4b). Algunas de las células de la umbrella tenían una forma redonda y mantenían los contactos celulares (Fig. 4c), mientras que otras células estaban altamente dañadas mostrando muchas vacuolas vacías dentro del citoplasma (Fig. 4d). La tasa de apoptosis fue mayor (Fig. 4e y Tabla 1). Por el contrario, las células musculares, con fibras orientadas radialmente (Fig. 4e, flecha) y las gónadas (Fig. 4f) estaban morfológicamente sin cambios.


Fig. 4. a) Micrografía SEM de una medusa four-leaf que muestra la ausencia de tentáculos (ampliación 2000x), b) Imagen estereoscópica de una medusa four-leaf, c) Células de forma redonda (aumento 3000x), d) vacuolización extensa de las células ectodérmicas (ampliación 2000x), e) células apoptóticas (asterisco) y células radialmente seccionadas de fibras musculares (flecha) (ampliación 3000x), f) gónadas (ampliación 2000x).



Definimos la cyst medusa como aquella que ha perdido todos sus tentáculos y la cavidad sub-umbrella que se hizo esférica (Fig. 5). Bajo SEM mostró una superficie lisa y regular (Fig. 5a). La observación por microscopía óptica reveló una estructura esférica de dos capas (Fig. 5b). La capa celular externa consiste principalmente de dos citotipos diferentes, que se distribuyen regularmente a lo largo de la superficie. En la Fig. 5b es posible distinguir células (probablemente células de la glándula “GC” principalmente localizadas en la parte derecha del cyst) con muchas células de fenestrae y una cantidad menor de inclusiones citoplasmáticas. Las células ricas en inclusiones citoplasmáticas (probablemente células cimógenas, “ZC”) se concentraron principalmente en la parte superior del cyst. En la Fig. 5b (asterisco) se muestra el contorno inicial probable del estolón, visto como una protuberancia de la parte izquierda del quiste. En contraste, la parte interna tenía una organización menos regular y podían ser reconocidas un gran número de células morfológicamente diferentes. Una distribución espacial específica, probablemente relacionada con el intenso proceso de reorganización de ésta etapa, se observó para las células que contienen un gran número de gránulos cimógenos en el citoplasma. Las células que rodean el contorno del estolón estaban extremadamente empacadas, casi herméticamente. La investigación ultraestructural TEM mostró que las células de la capa externa habían restablecido contacto (Fig. 5C y D) perdido en las etapas anteriores. Las células frenestrae de la capa superficial se encontraban en contacto entre sí y estaban separadas de la capa interna celular del cyst por sustancias compactas y homogéneas, probablemente mesoglea (Fig, 5C, mes). LA interacción entre células se observó en la capa interna del cyst, mientras que las células aisladas todavía podían ser reconocidas en el centro del quiste (Fig. 5e). Muchas de éstas células mostraron cromatina condensada, como se evidencia por tinción de plata (Fig. 5f) y se confirma por la observación TEM (Fig. 5g), indicando así la presencia de una intensa actividad de apoptosis. Las gónadas (Fig. 5i) también estaban presentes en ésta fase, así como en el tejido muscular (Fig. 5h) en el cyst con estolones.


Fig. 5. a) Micrografía SEM de un cyst que muestra la superficie casi lisa (ampliación 3000x), b) sección semidelgada de un cyst. Se muestran dos capas celulares. En la capa exterior es visible la parte externa del estolón (Véase Resultados para más detalles) (ampliación 1500x), c) micrografía TEM de células fenestradas de la capa externa. Se puede ver la mesoglea (mes) (ampliación 3000x), d) células vacuoladas y aisladas de la parte central del cyst (2000x), e) una célula apoptótica en necrosis secundaria en la parte central del cyst (ampliación 2000x), f) Tinción de plata metanamina de un quiste. Son visibles muchos núcleos con cromatina condensada (apoptóticos), en particular en la región central, g) micrografía TEM de células fenestradas de la capa externa con un núcleo intacto y en forma de viga (ampliación 2000x), h) células musculares diferenciadas con sarcómeros claramente visibles en la parte del cyst que esta cerca del estolón (ampliación 2000x), i) gónadas (ampliación 2000x).




Mediante el uso de lectinas FITC conjugadas, se estudió el residuo del sacárido en la superficie de las células de T. nutricula durante los estados de pólipo, healty medusa y unhealthy medusa.

Se observaron diferencias significativas entre healty medusa y unhealty medusa (Fig. 6). Se observaron los sitios de unión ConA, Ricinus communis y Ulex en todos los estadios estudiados, pero a través de un microscopio confocal se observaron las diferencias en la distribución y la intensidad de la fluorescencia. La fluorescencia fue bastante intensa en las gónadas de la unhealty medusa, mientras que las gónadas de la healty medusa se marcaron en un grado mucho menor. Las células que recubren los canales radiales fueron también fuertemente marcadas y el marcado aumentó en la unhealty medusa. En la umbrella, las células de la healty medusa mostraron poco marcado con pequeños grupos pequeños de fluorescencia. Al contrario, el marcado aumentó en la unhealty medusa así como el número de puntos fluorescentes. El marcado observado en el pólipo se distribuyó homogéneamente en todo el tejido, con una intensidad de fluorescencia comparable con el de la heatly medusa.

Fig. 6. Imágenes confocales de T. nutricula (estados de pólipo, healthy medusa y unhealthy medusa). Secciones marcadas con lectinas FITC fluorescentes conjugadas.



Discusión

El ciclo de vida poco común de T. nutricula implica la transformación de la medusa adulta en un pólipo, lo que algunos autores consideran una etapa juvenil (Boero et al., 1997). Este evento representa un desarrollo revertido envuelve un proceso crucial que se caracteriza por modificaciones drásticas, comparables a un especie de metamorfosis. Durante la metamorfosis una gran parte de la población celular adquiere las características de células adultas totalmente diferenciadas (Truma, 1984; Weis y Buss, 1987). Además, este proceso, que ocurre en muchas especies de vertebrados e invertebrados, se acompaña a menudo de procesos degenerativos y apoptóticos, bien descritos por la reabsorción de la cola de los anfibios (Sanders y Wride, 1995).

Nuestro estudio ultraestructural de las modificaciones celulares durante el ciclo de vida reverso de T. nutricula ha demostrado la presencia tanto de procesos degenerativos como apoptóticos. La degeneración es prevalente durante los estados de unhealty medusa y four-leaf clover, mientras que la tasa de apoptosis es mayor durante los estados de unhealty medusa y cyst. La presencia de sucesos apoptóticos, incluso en la healthy medusa, no es sorprendente debido a su papel en la preservación de la homeostasis celular en la mayoría de los animales (Wyllie et al, 1980; Gupta, 1996). La apoptosis también juega un papel importante en muchos procesos de desarrollo, tales como la diferenciación celular, ovogénesis (Sommer et al, 1998), organogénesis, así como en el establecimiento de las estructuras del cuerpo (Jacobson et al, 1997; Sanders y Wride, 1995). La existencia de la apoptosis y su papel morfogenético durante la reorganización del cuerpo (de larva a pólipos) de Hydractinia echinata fue descrito por primera vez por Seipp et al. (2001). En el ciclo inverso de T. nutricula la presencia de procesos degenerativos, así como la apoptosis apoya nuestra idea de que la inversión es una especie de metamorfosis, utilizada para reorganizar la estructura del cuerpo.

La etapa cyst es la más intrigante de el ciclo revertido de T. nutricula, ésta etapa tiene una organización morfológica similar a la de la larva plánula: las células se organizan en dos capas diferentes. Por lo tanto, podría suponerse que las modificaciones celulares (degeneración, apoptosis y diferenciación) durante la etapa cyst son similares a las que caracterizan la metamorfosis fisiológica de plánula a pólipo, se deduce que la etapa de cyst no es una etapa de reposo, sino más bien la etapa más activa y, de hecho, la tasa de apoptosis podría ser un mecanismo de selección celular, necesario para la reorganización del cuerpo y el desarrollo de tejidos y estructuras del pólipo.

El proceso de apoptosis se descrito en healty medusa y en otra etapas, principalmente la etapa cyst podría tener diferentes propósitos. En la healty medusa, la apoptosis es el proceso normal para mantener la homeostasis celular, por el contrario en el cyst, la apoptosis conduce a una espectacular reorganización del cuerpo, un proceso similar que ha sido previamente descrito en animales superiores, tales como Drosophila (Jiang et al., 1997) o anfibios (Tata, 1993), en el que la apoptosis sirve para eliminar las características típicas de la larva, y simultáneamente preservar aquellas células que sirvan para construir estructuras adultas. También son  interesantes los resultados relativos al mantenimiento de las gónadas en todas las etapas. Esto representa una evidencia clara de que tanto las jóvenes como las medusas maduras son capaces de revertir su ciclo de vida. Se están realizando más estudios para investigar su posible participación en la reconstrucción de la estructura del pólipo.

Las modificaciones morfológicas estructurales que tienen lugar durante la reversión del ciclo de vida de T. nutricula subrayan, por supuesto, los diversos cambios bioquímicos y moleculares que afectan a todos los compartimientos de la célula. Esta idea es apoyada por los datos obtenidos con el microscopio confocal y lo reportado acerca del análisis de distribución de lectinas en los sitios de unión. Con este instrumento muchas secciones de la muestra se analizaron y obtuvieron claras imágenes a través de una eliminación virtual de fluorescencia fuera de foco, aumentando así la claridad y el contraste de las imágenes (Diaspro, 2002). En la unhealty medusa se observó una alta exposición de residuos de azúcar en la superficie, lo que indica que la reorganización de la superficie celular se lleva a cabo durante esta etapa, posiblemente para suprimir los contactos celulares y preparar la reorganización celular en la fase de quiste.

En conclusión, se ha demostrado la presencia de procesos tanto degenerativos como apoptóticos durante el ciclo inverso de vida de Turritopsis nutricula. Estos resultados morfológicos apoyan la idea de que cuando una medusa se transforma en un pólipo ocurre una especie de metamorfosis.


Referencias
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Las áreas más nuevas de la Biología Molecular son justamente las antiguas áreas de la Biología Clásica.
-Brenner